英雄联盟之不败神话小说:酵母蛋白表達系統

本文詳細講述了酵母表達表現型Mut+和Muts,酵母表達同源重組方式整合分析,酵母表達載體選擇及其與大腸桿菌表達系統的區別,酵母表達原理及酵母蛋白表達實驗SOP。
下載

酵母蛋白表達系統

英雄联盟女英雄 www.kqhtn.icu 酵母表達系統是真核表達蛋白的常用系統之一,具有真核表達系統的許多優點:如蛋白加工折疊、翻譯后修飾等。且酵母蛋白表達的操作較哺乳動物來說相對簡單。同為酵母表達系統,畢赤酵母表達系統比釀酒酵母表達系統表達水平更高且可進行細胞的高密度培養。巴斯德畢赤酵母是近幾年發展起來的較為完善,被廣泛用來表達外源蛋白的甲醇營養型酵母表達系統。(下文所提到的酵母蛋白表達均為巴斯德畢赤酵母)

酵母蛋白表達與大腸桿菌表達的區別

酵母蛋白表達與大腸桿菌表達部分不同,大腸桿菌表達只需將質粒/載體轉入到宿主菌體內,其載體攜帶復制原點隨著宿主染色體的復制而復制,可以穩定存在。而酵母表達相對復雜,設計的質粒/載體均不帶有酵母自身復制原點,因此如果直接導入到宿主菌中,不能穩定存在。所以必須將質粒/載體線性化,以同源重組的方式與宿主菌的染色體進行整合,這樣外源基因才能夠穩定存在,而且同源重組一旦形成會很穩定,在通過后期的篩選排除沒有整合成功的質粒/載體和宿主菌,挑選整合成功并能夠高表達的重組轉化子,某種程度上與哺乳動物穩定細胞系構建原理類似。

畢赤酵母蛋白表達系統構成

  1. 酵母表達宿主菌
  • Mut+和Muts

在畢赤酵母表達系統中,乙醇氧化酶有兩種基因編碼,即AOX1和AOX2。細胞中絕大多數乙醇氧化酶活力有AOX1提供,菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表達的AOX1蛋白提供。當AOX1缺失,只存在AOX2時,大部分的乙醇氧化酶活力喪失,這種細胞利用甲醇能力低,在甲醇培養基上生長緩慢的菌株表現型為Muts。存在AOX1,細胞利用甲醇正常生長,在甲醇培養基上生長較快,這種菌株表現型為Mut+,這就是甲醇營養型畢赤酵母表達兩種Muts和Mut+產生的原理。

  • 酵母表達系統常用宿主菌

GS115、KM71、SMD1168是常用的表達宿主菌,均為甲醇誘導型。他們都是組氨酸缺陷型,如果表達載體上帶有組氨酸基因,可以補償宿主菌的組氨酸缺陷,所以可以在不含組氨酸的培養基上篩選重組轉化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養基上生長時,AOX1基因的表達受到抑制,而在以甲醇為唯一碳源時,宿主菌的AOX1基因被強烈誘導,使目的基因大量表達。

  • 有無甲醇誘導產生的Mut+和Muts表現型

畢赤酵母的最適生長溫度為28-30℃,誘導期間超過32℃,不利于蛋白表達,并可能導致細胞死亡。Muts和Mut+菌株在沒有甲醇存在的情況下生長速率一樣,存在甲醇的情況下,AOX1啟動子被強烈誘導,Mut+較Muts生長更快(4-5倍)。

  1. 酵母蛋白表達載體
  • 酵母蛋白表達載體的選擇

酵母表達產物有胞內表達和分泌到胞外表達兩種方式,這取決于表達載體的選擇和構建是否帶有信號肽,可根據基因表達的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達載體。

①?胞內表達載體:主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。該類載體將目的基因表達在胞內,可避免酵母的糖基化,適合于通常在胞漿表達或不含-S-S-的非糖基化蛋白,較胞外分泌表達水平高但純化相對復雜。

②?分泌到胞外表達的載體:pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少,將外源蛋白分泌到胞外,有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號序列由89個氨基酸組成α交配因子的引導。

③?多拷貝插入表達載體:pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下,重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達量。

  • 表達重組蛋白使其具體天然的N端

想實現表達重組蛋白使其具體天然的N端,將目的基因直接連接在Kex2蛋白酶切位點之后。Kex2蛋白酶切位點在信號肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala??*位置為Kex2蛋白酶的酶切位點

畢赤酵母表達系統機制/原理

畢赤酵母能夠高效的表達外源基因,是因為其具有強啟動子乙醇氧化酶啟動子(AOX1和AOX2)。AOX1和AOX2及其產生的Muts和Mut+表現型前文已經敘述過。AOX1受甲醇的誘導和葡糖糖或甘油的抑制。畢赤酵母表達的外源基因位于酵母染色體上,通過把構建的質粒/載體線性化(主要采用酶切),通過同源重組的方式整合到啟動子AOX的下游,一般是插入到5’AOX啟動子和轉錄終止子信號之間的單克隆位點。

  1. 畢赤酵母同源重組的方式

質粒/載體和酵母表達基因圖譜

載體圖譜

圖1:載體圖譜:5’AOX1啟動子位點,

轉錄終止子TT,3’AOX1位點

酵母宿主菌基因

圖2:酵母宿主菌基因

  • 質粒載體上的PAOX位點(PAOX啟動子)或PAOX轉錄終止子TT或下游3’AOX1三個位點與酵母宿主菌基因發生同源重組

在酵母宿主菌基因組的下游或者上游插入一個或多個質粒載體基因。如插入的質粒載體不破壞酵母宿主菌基因本身的AOX1,因此重組轉化子的表現型不變為Mut+,反之為Muts。

重組質粒插入3‘AOX

圖3:重組質粒插入3’AOX1

  • 質粒/載體基因替換酵母宿主菌的AOX1位點

酵母宿主菌的AOX1啟動子位點被質粒/載體基因完全替代,原有的酵母AOX1啟動子被破壞,表現型為Muts,取代其的是質粒/載體基因組上的PAOX,目的基因,HIS4表達序列。取代事件發生的不如基因插入事件發生的多。

酵母宿主菌基因

圖4:AOX1位點被替換

酵母宿主菌

  • 多拷貝插入

簡單來說就是質粒/載體基因的多次插入(插入到酵母宿主菌基因組上),自發概率很低

多拷貝插入

酵母表達轉化方法比較

培養好的酵母宿主菌和構建好的質粒進行同源重組的轉化方法有以下幾種,都是基于線性化質粒/載體之后,線性化是轉化的第一步,用限制酶酶切。

  • 轉化方法
轉化方法 轉化效率 是否會多拷貝整合 操作
原生質體法 105 操作復雜
電穿孔法(電擊) 105 操作方便
PEG誘導轉化 103 操作方便

畢赤酵母表達系統主要優點

  • 具體醇氧化酶(AOX)基因的啟動子,可嚴格調控,實現高水平表達
  • 強烈的好養生長偏愛性,可進行細胞高密度培養,發酵罐可達120g/L
  • 具有真核細胞翻譯后修飾的功能,蛋白更具生物活性
  • 高水平分泌表達外源蛋白,有利于純化
  • 可實現胞內表達和胞外分泌表達兩種形式

酵母蛋白表達影響因素

  1. 啟動子的選擇
    酵母表達系統常用的是醇氧化酶基因啟動子PAOX,具有強誘導性和強啟動性。PGAP啟動子是畢赤酵母中克隆到的一個組成型啟動子,在PGAP控制下,LabZ基因表達比甲醇誘導下PAOX表達量更高,且不需要甲醇誘導,放大工藝更加簡便。
  2. 目的基因的優化
    目的基因決定表達成敗的首要因素。由于密碼子的簡并性,不同的表達系統都有其特定的偏愛密碼子。所以在基因合成時便要進行密碼子的優化(可見密碼子優化詳解),換掉稀有密碼子并進行mRNA結構優化,提高蛋白表達量,防止蛋白不表達或表達量低。
  3. 影響蛋白分泌的因素
    如果蛋白本身不易分泌,即不適分泌表達,可嘗試在用釀酒酵母的α-AMF(交配因子)信號肽序列,對胰島素、凝血因子等小分子有用,在α-AMF和目的基因之間插入間隔肽能夠提高目的蛋白的表達水平。信號肽會影響蛋白分泌表達的水平。此外,其他影響因素還包括重組轉化子的篩選,遺傳背景影響,蛋白的穩定性影響等。

酵母蛋白表達實驗操作(SOP)

本文的酵母蛋白表達是簡單敘述實驗的主體流程,詳細的標準操作流程見蛋白表達專題總頁:酵母蛋白表達步驟(SOP)。

感受態細胞的制備

對質粒進行不同方式的轉化需要制備不同的感受態細胞狀態。且酵母表達的感受態細胞最好現做現用,感受態對轉化效率有很大影響。在酵母表達SOP中包括電轉,PEG1000和原生質法三種轉化的感受態細胞制備方法。

酵母的轉化

包括三個轉化方法操作步驟:原生質法轉化,電轉化,PEG1000

陽性轉化子的篩選與蛋白表達

對轉化后的酵母宿主菌進行篩選,篩選出成功實現同源重組的轉化子,進行誘導表達

詳細的酵母蛋白表達標準操作流程見蛋白表達專題總頁酵母蛋白表達SOP

返回蛋白表達專題

僅供科研

聯系我們

電話:(025)5889-4959

咨詢:[email protected]

地址:南京市高新開發區星火路10號

英雄联盟女英雄