英雄联盟官网助手:離子交換色譜的原理介紹和實際操作

英雄联盟女英雄 www.kqhtn.icu 摘要:本文主要從基礎原理與實驗設計思路兩個方面講述了蛋白純化實驗中離子交換色譜的應用,并附有AKTA離子交換色譜操作案例。

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基本原理

離子交換色譜是蛋白純化技術中常用的一種純化方法,其原理是指被分離物質所帶的電荷可與離子交換劑所帶的相反電荷結合,這種帶電分子與固定相之間的結合作用是可逆的,在改變pH或者用逐漸增加離子強度的緩沖液洗脫時,離子交換劑上結合的物質可與洗脫液中的離子發生交換而被洗脫到溶液中。由于不同物質的電荷不同,其與離子交換劑的結合能力也不同,所以被洗脫到溶液中的順序也不同,從而被分離出來。

離子交換色譜純化原理

離子交換劑是由不溶于水的網狀結構高分子聚合物骨架構成,骨架上有許多共價結合的帶電基團,如果側鏈是帶正電基團,就可與帶負離子相結合,稱為陰離子交換劑,吸附帶負電蛋白質。如果側鏈是帶負電的基團,則稱為陽離子交換劑。強離子交換樹脂在寬pH范圍內保持離子化,而弱離子交換樹脂只在窄pH值內離子化。

類型 名稱 英文符號
陰離子交換劑 二乙基氨乙基
季氨基乙基
季氨基
三乙基氨乙基
氨乙基
DEAE
QAE
Q
TEAE
AE
陽離子交換劑 羧甲基
磺丙基
磺甲基
磷酸基
CM
SP
S
P

絕大多數重組蛋白純化都要用到離子交換。離子交換色譜的基礎是高分辨率,可以直接放大規模應用在工業上,柱再生容易,還可以使蛋白濃縮。大多數蛋白質的靜電荷是負值,因此陰離子交換色譜的應用最為廣泛。

實驗設計

介質的選擇

離子交換介質首先要考慮目的分子的大小,因為目的分子會影響其接近介質上的帶電功能集團,因此也會影響介質對目的分子的動力載量,從而影響其分離。

對于大多數純化步驟來說,建議從開始的階段使用強離子交換柱,可在摸索方法的過程中有一個寬的pH范圍。對于已知等電點的蛋白質,可根據其等電點來選擇。而未知等電點的蛋白質,在實際操作中常采用這樣的方法,先選擇一個陰離子交換劑,再選擇一個中性的pH緩沖液,將蛋白質樣品透析至pH7.0,然后過陰離子交換柱。根據過柱后的結果確定下一個使用的緩沖液pH。

流動相的選擇

離子交換色譜的流動相必需是有一定離子強度的并對pH有一定緩沖能力的溶液。為了避免目的蛋白失活,使用緩沖液可穩定流動相的pH,使之在色譜過程中不發生明顯變化,同時可穩定目的分子上的電荷量,保證色譜結果的重要性。

選擇緩沖液一般按照以下原則:陽離子交換劑應選用陰離子緩沖液,可用檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸鹽等;陰離子交換劑應選用陽離子緩沖液,可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等;起始緩沖液的濃度應盡可能低(<100mmol/L)這樣可以使色譜柱上更多的吸附分離物質;緩沖液應不含會影響被分離物質活性和溶解度成分,洗脫時盡量不采用pH梯度洗脫。

色譜柱的選擇

離子交換色譜通常選用粗短柱,即高徑比小的色譜柱。典型的離子交換柱高度在5~20cm,高徑比一般小于5。如果需要增加離子交換劑的體積,只能從增加柱的直徑而不能增加其高度。如果是連續梯度洗脫,可以適當增加柱的長度。

案例介紹(AKTA Pilot)系統

離子交換是蛋白純化中的重要手段,即可以用于捕獲階段,也可以用于精純階段。

預處理和裝柱

  1. 將超純水與沉降膠按1:3比例懸浮,輕輕攪勻;
  2. 將色譜柱固定到設備支架上,鏈接出口管道,從柱底端進口反向泵入超純水,排除管道及篩板中的氣泡,停泵,然后從出口端放出部分超純水,保留1~2cm高度超純水,封死出口端,然后正向沖洗進口端管道和適配器,排除篩板和管道中氣泡;
  3. 通過玻璃棒引流將懸浮膠導入色譜柱,在柱上端補充部分超純水,攪勻,裝上適配器;
  4. 將柱出口端與色譜設備連接,以0.2MPa恒壓裝柱,裝填至恒定的柱床高度,標記柱床膠面位置,關閉泵,松開適配器,降低適配器至膠面下2mm處,繼續裝填,待柱床高度穩定后,標記柱床膠面位置,降低適配器至柱上標記柱床位置下2mm。固定適配器,繼續裝填2~3柱體積;
  5. 確定柱體積,測量柱高,計算柱體積及記錄裝柱時的最大流速;
  6. 選擇最佳線速,用0.5mol/L NaOH沖洗柱,沖洗3~5體積;
  7. 接著用超純水沖柱,沖洗10柱體積,至pH顯示接近超純水pH。

柱的平衡

20mmol/L磷酸鹽緩沖液,pH6.5,用10柱體積平衡緩沖液平衡柱子,直至pH及電導率監控顯示與平衡緩沖液的pH及電導一致。

加樣

根據柱體積及裝柱的最大流速確定上樣流速,上樣流速不超過裝柱最大流速的75%,同時,上樣流速也要盡可能低,保證樣品和介質充分發生作用。

洗脫

上樣結束后,用平衡緩沖液沖洗1~2柱體積,使UV280響應信號重新回到基線。

之后用含有0.5mol/L NaCL的溶液洗脫,沖洗2~3柱體積,收集色譜峰。

常見問題分析

  1. 純化后樣品純度不高怎么辦?
    • 若目標蛋白和雜蛋白等電點差異較大,目標蛋白通過穿透步驟獲得,通過調節起始緩沖液pH,使目標蛋白與填料之間的靜電作用更強;
    • 若目標蛋白和雜蛋白等電點差異較小,目標蛋白通過洗脫步驟獲得,過調節起始緩沖液pH,使目標蛋白與填料之間的靜電作用更強;再調節洗脫溶液的離子強度和pH,使目標蛋白與雜蛋白逐漸分離;
    • 選擇合適的離子交換填料及粒徑;
    • 柱沒有經過起始緩沖液的充分平衡;
    • 降低洗脫流速;
    • 調整樣品溶液黏度。
  2. 純化后的蛋白收率較低怎么辦?
    • 調整樣品pH,使樣品pH與起始緩沖液pH保持一致;
    • 改變洗脫模式,如將線性梯度模式改變為階段性梯度洗脫;
    • 改變洗脫方法,如將pH洗脫方法改為鹽梯度洗脫方法;
    • 改變洗脫強度。
  3. 樣品過于粘稠怎么處理?
    • 樣品過于粘稠可能是由于含有的蛋白太多,或者含有大分子量的核酸分子,通常有以下解決方法:
    • 增加裂解前稀釋細胞所用體積;
    • 增加裂解時間,直至黏度下降,或者增加DNase和Mg2+的劑量;
    • 增加機械裂解細胞的效率;
    • 降低上樣流速。
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