英雄联盟游戏下载官方下载最新版:蛋白相互作用檢測方法綜述

英雄联盟女英雄 www.kqhtn.icu 下載蛋白質功能的發揮不是憑借單個蛋白質獨立執行,而是依靠蛋白間相互作用(protein-protein interaction, PPI)執行其功能。因此,研究蛋白之間的相互作用對于深入了解許多生命過程具有非常重要的意義。本文主要介紹了常見的蛋白質相互作用研究方法,包括體內方法(免疫共沉淀、酵母雙雜交等)及體外方法(GST-pull down、生物膜干涉技術、表面等離子共振等)。

檢測范圍 檢測方法
In vivo
體內方法
免疫共沉淀(Co-IP)
熒光共振能量轉移(FRET)
鄰近蛋白標記BioID
酵母雙雜交(Yeast Two-hybrid)
TAP串聯親和純化技術
雙分子熒光互補技術(BiFC)
In vitro
體外方法
融合蛋白沉降技術(GST?Pull down)
生物膜干涉技術(BLI)
表面等離子共振(SPR)
Far-Western
蛋白質芯片技術(Protein microarrays)
噬菌體展示技術

體內檢測方法

免疫共沉淀

免疫共沉淀以抗原抗體間的特異性為基礎,檢測分子間的相互作用,實驗操作簡便。利用蛋白X的抗體去免疫沉淀(通過瓊脂糖微珠)蛋白X,免疫共沉淀這樣在蛋白X所在的環境中與其有相互作用的分子(Y)會被一起沉淀下來,在通過Western Blot去檢測免疫沉淀的結果。

該技術是研究蛋白質相互作用的經典技術,應用廣泛且可信度較高。它利用特異性抗體從細胞抽提物中分離目的蛋白和相互作用蛋白的復合物,之后通過Western?blot及質譜法確定相互作用蛋白。如果在非變性的條件下裂解細胞,蛋白間相互作用可以保持,所以就可利用免疫共沉淀方法找出相互作用的蛋白質。免疫共沉淀既可以用于檢驗已知的兩個蛋白質在體內的相互作用,也可以找出未知的蛋白質相互作用,不管是哪個,其原則都是一樣的,都需要用特異性的抗體與其中的一種蛋白質結合,之后通過蛋白質A或蛋白質G瓊脂糖微珠將復合物沉淀下來,然后用SDS PAGE鑒定。免疫共沉淀中設置正確的對照非常重要,因為該方法可能出現假陽性的概率比較高。設置的對照包括:在對照組中使用對照抗體,以缺失目的蛋白的細胞系作為陰性對照等等。(詳細免疫共沉淀實驗介紹)

熒光共振能量轉移(FRET)

原理:熒光能量共振轉移是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象。當供體熒光分子的發射光譜與受體熒光共振能量轉移(FRET)熒光分子的吸收光譜重疊,并且兩個分子的距離在10nm范圍以內時,就會發生一種非放射性的能量轉移,即FRET現象,使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多(熒光猝滅),而受體發射的熒光卻大大增強(敏化熒光) 。

熒光共振能量轉移(?FRET)是用于對生物大分子之間相互作用定性、定量檢測的一種有效方法。根據所基于的熒光顯微鏡配置不同而有不同的應用側重,可在溶液,細胞懸液,多細胞,單細胞,細胞膜,細胞器等不同層次對生物大分子間的相互作用距離,動力學特性等進行研究。在生命科學領域,FRET技術是檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具,可用于檢測某一細胞中兩個蛋白質分子是否存在直接的相互作用。正如前述,當供體發射的熒光與受體發色團分子的吸收光譜重疊,并且兩個探針的距離在10nm范圍以內時,就會產生FRET現象。而在生物體內,如果兩個蛋白質分子的距離在10nm之內,一般認為這兩個蛋白質分子存在直接相互作用。(詳細FRET熒光共振能量轉移介紹)

鄰近蛋白標記BioID

原理:鄰近蛋白標記,顧名思義就是將靠近某一被標記的物質的蛋白或分子標記。例如,A是重組表達獲得的帶有BirA*生物素連接酶BioID鄰近蛋白標記的蛋白,BirA*是BirA的一種突變體,BirA需要特異性識別一段15AA的氨基酸序列,才能將靠近其的蛋白生物素化,經過突變的BirA*不需識別特定的氨基酸也能使其周圍的分子生物素化
應用:
1)已經被成功地運用到研究哺乳動物細胞和單細胞原核生物的各種各樣的蛋白中;
2)特別適用于研究不易溶解或者很難得到的亞細胞結構蛋白;
3)能夠檢測弱的,瞬時的蛋白相互作用。

酵母雙雜交(Yeast Two-hybrid)

原理:待研究的蛋白分別融合到Gal4p轉錄因子的獨立DNA結合域及轉錄激活結構域,如果這兩種蛋白本身有相互作用,它們便可重組成一個功能性的Gal4p,從而酵母雙雜交誘導報告基因的表達。該方法可測定兩種蛋白相互作用的能力,轉錄報告系統可用來評價此相互作用。此外,使用這種方法還可以從蛋白庫中篩選與未知的相互作用蛋白,這也是酵母雙雜交系統的另外一特點。
酵母雙雜交是一種在酵母中利用轉錄激活物的重組來鑒定蛋白質之間相互作用的方法。簡言之,就是誘餌蛋白質基因與一個報道基因DNA結合區融合表達,而在目的蛋白質基因上融合表達報道基因的激活區,如果這兩個蛋白質間有相互作用,則可以激活報道基因的表達,從而從文庫中釣出特異作用的蛋白質。后來又有研究者在細菌中進行雙雜交。這個方法的優點是(1)細菌雙雜交比酵母的文庫更大,可以大于108;(2)細菌雙雜交可以鑒定一些在酵母中無法進行操作的蛋白質。
(詳細酵母雙雜交系統介紹)

TAP串聯親和純化技術

TAP 串聯親和純化技術該技術是研究生理條件下蛋白質相互作用的方法,它利用特殊設計的蛋白標簽,經過連續的親和純化得到接近自然狀態的蛋白復合物。該方法假陽性率和假陰性率低,可分析穩定復合物中蛋白質相互作用及瞬時相互作用,采用兩步親和純化使特異性得到提高,具備通用性及自動化等優勢;但TAP標簽可能會影響靶蛋白與親和柱的結合,以及純化中使用的螯合劑有時會干擾蛋白質復合物的完整性和活性。(詳細TAP串聯親和純化技術介紹)

體外檢測方法

融合蛋白沉降技術(GST Pull-down)

GST pull-down利用重組蛋白表達技術將GST與目的蛋白融合,利用GST和谷胱甘肽偶聯球珠的親和性,從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白。GST與谷胱甘肽之間的親和力較高,不是一般的緩沖液可以解離,大量的GST融合蛋白就能與固定在基質上的谷胱甘肽結合。GST與嵌合的蛋白質之間有一段長的柔性連接段,使得GST和目的蛋白形成兩個各自獨立的功能域,因此GST并不阻礙其他蛋白質與融合蛋白的相互作用。利用這些特點,可以利用谷胱甘肽簡單、高效的親和純化出相互作用的蛋白。

Far-western?blotting

Far-western?blotting ?該技術是由Western?blotting?衍生而來研究蛋白質相互作用的方法,它運用經標記的或可被抗體檢測的“誘餌”蛋白檢測轉移膜上的“獵物”靶蛋白。如果誘餌蛋白與靶蛋白存在相互作用,那么利用該誘餌蛋白的特異性即可檢測出相應條帶。利用該技術檢測了DNA復制和修復相關蛋白質之間的相互作用,認為這是一種快速有效、可重復的 蛋白質相互作用研究方法。該方法檢測兩種蛋白質是否發生直接的相互作用,如果相互作用是間接的,可以用候補蛋白進行進一步檢測。由于該方法靈敏度較高,現已得到廣泛的應用。
(詳細Far-western blot技術介紹)

蛋白質芯片技術(protein microarryays)

蛋白質芯片技術Protein microarrays蛋白質芯片是將各種蛋白質有序地固定于固相支持物表面制成芯片,然后將帶有特殊標記(如熒光染料)的樣品蛋白質與芯片上的探針蛋白雜交,漂洗未能與芯片上的探針蛋白結合的蛋白,再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃描技術測定芯片上各點的熒光強度,通過熒光強度分析蛋白質相互作用, 最終確定蛋白質功能。該方法快速、簡便、高通量,可檢測出一些通常難以鑒定的低豐度、小相對分子質量蛋白,但與靶蛋白結合的特異性有待提高。(詳細蛋白質芯片技術介紹)

噬菌體展示技術

噬菌體展示技術是將編碼目的蛋白的基因與編碼噬菌體表面蛋白的基因融合后 ,以融合蛋白的形
式表達在噬菌體表面的一種技術。將不同的外源基因分別插入噬菌體載體中,隨著噬菌體的傳代,外源蛋白會展現在噬菌體表面,形成噬菌體文庫。將“誘餌 ”蛋白固定化 ,基于“誘餌 ”蛋白與“獵物 ”蛋白之間的相互作用 ,可將展示庫中與固定化的“誘餌 ”蛋白有相互作用的“獵物 ”蛋白分離純化出來 ,再對“獵物 ”蛋白進行質譜鑒定。噬菌體展示技術常用于構建隨機肽庫、抗體庫和蛋白質庫 ,研究受體或抗體的結合蛋白及相互作用位點。噬菌體展示技術的優點是能夠將表達蛋白和編碼基因完美地聯系起來 , 并具有高通量、高選擇性等特點。缺點是噬菌體可以組裝的基因大小有限 ,限制了插入蛋白基因的長度和數量 ,同時宿主可能會引起某些蛋白的不正確折疊或修飾而影響蛋白的結合能力,最終影響實驗結果。(詳細噬菌體展示技術介紹)

展望

細胞中有些蛋白質相互作用是瞬時、不穩定的,以實驗為基礎的研究方法較難檢測到這些相互作用,而運用生物信息學則彌補了這一缺陷,但運用生物信息學分析蛋白質相互作用也存在局限性,如方法標準多樣、蛋白質相互作用數據庫沒有飽和,以及相互作用的結構、親和力、特異性信息缺乏等。然而,我們相信,隨著科技的發展,生物信息學方法會得到進一步完善,為蛋白質相互作用研究提供快速有效的方法。 目前,大規模蛋白質相互作用網絡圖譜(包括酵母、果蠅、線蟲、線粒體以及人類等)已經被成功繪制,使蛋白質相互作用研究成為生命科學領域的一個熱點,為探索疾病的發生發展機制開辟了新道路。通過蛋白質相互作用的特異性抑制,為尋找新的藥物靶標、研發新藥以及治療疾病開創了新思路。

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